Владимир Комаров начал готовиться к старту в 1965 году, полет должен был пройти на новом многоместном советском корабле серии "Союз". У 38-летнего космонавта за плечами уже был опыт полета на околоземную орбиту: в октябре 1964-го на борту корабля "Восход" он вместе с Константином Феоктистовым и Борисом Егоровым совершил двухдневный вояж в космос. За это время корабль 16 раз облетел земной шар.
За успешное выполнение полета Владимиру Комарову было присвоено звание Героя Советского Союза, вручены орден Ленина и медаль "Золотая Звезда". Вскоре ему присвоили квалификацию "космонавт третьего класса", а в январе 1965 года назначили инструктором в группу космонавтов, готовившихся по программам Министерства обороны СССР.
Второй полет Комарова, начавшийся 23 апреля 1967 года, оказался роковым: он погиб на следующий день во время экстренного спуска на Землю. При выполнении финального маневра не раскрылся основной парашют спускаемого аппарата, а стропы запасного скрутились из-за сильного вращения. На скорости около 100 километров в час спускаемый аппарат врезался в землю в Оренбургской области и загорелся.
Коллега Комарова, космонавт Алексей Леонов в интервью ТАСС рассказал, что изначально планом полета предусматривалось следующее: Комаров стартует на "Союзе-1", после успешного выхода на орбиту вслед за ним отправляется "Союз-2" с тремя членами экипажа – Валерием Быковским, Евгением Хруновым и Алексеем Елисеевым. Двум последним после стыковки кораблей "Союз" на околоземной орбите предстояло выйти в открытый космос и перейти с борта второго "Союза" в корабль Комарова, вместе с которым вернуться на Землю. Дублером Комарова был назначен Юрий Гагарин, рвавшийся в космос.
Через 540 секунд после запуска корабль вышел на орбиту. На втором витке с Комаровым была установлена связь, и тот смог доложить на Землю, что одна из солнечных батарей не раскрылась. В ЦУПе было принято решение прекратить полет.
Трагическое стечение обстоятельств привело к гибели Владимира Комарова. Вот как описывает увиденное в оренбургской степи Алексей Леонов: "За счет того, что есть собственный кислород, металл горел как дерево. Когда комиссия прилетела на место, увидели удручающую картину: корабль осел и выглядел как песчаный холм высотой около одного метра. И металл расплавленный был, как лужа воды".
Впоследствии некоторые СМИ писали о якобы страшных криках Комарова, которые слышали в радиоэфире на Земле, и что он перед смертью сильно ругался на конструкторов, создавших корабль. Леонов назвал домыслы журналистов глупостью.
За героизм, мужество и отвагу, проявленные во время полета, Владимира Комарова посмертно наградили второй медалью "Золотая Звезда". Международный комитет по аэронавтике и космическим полетам отметил его подвиг орденом "Роза ветров" с бриллиантами.
Прах Владимира Комарова захоронен в Кремлевской стене на Красной площади в Москве. На месте гибели космонавта в степи под Орском в Оренбургской области установлен мемориал.